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An in Vivo Imaging Assay Detects Spatial Variability in Glucose Release from Plant Roots
发布日期:2019-01-04  作者:邵晨  浏览量:98

文章链接:http://apps.webofknowledge.com/full_record.do?product=UA&search_mode=GeneralSearch&qid=1&SID=8CB1uEv9MZT329fbyrP&page=1&doc=1

实验目的:understand how carbonmoves from the roots into the rhizosphere by obtaining data on spatial andtemporal variability in sugar exudation using the technique .
先前技术的局限性:
2.1radioactive tracers:Radioactive sugars (or sugar analogs) are fed through a cut surfaceof the plant, or alternatively, radioactive carbon dioxide is fed to beincorporated into the plant by photosynthesis, and the movement of the tracerin the plant and into the rhizosphere is tracked by radiation detectors. (放射性糖 (或糖类似物) 通过植物的切割表面供给,或者通过光合作用将放射性二氧化碳送入植物, 并通过辐射探测器追踪糖类在植物和根际的运动。)
Advantage: This enables monitoring of the spatial and temporal movement ofsugars within the plant and into the rhizosphere.
Disadvantage: these radioactivitytechniques cannot provide information about the composition of the labeled exudatesbeing released and cannot identify the metabolites being released(被测物的成分不一定能检测,而且不能识别释放的代谢物)2.2hydroponic solution (or sterilemedium), collect the exudates + chromatography and/or mass spectrometry techniques:they cannot provide information about the spatial differences in root exudationprocesses.(水培溶液(或无菌培养基),收集渗出液+色谱和/或质谱技术:无法提供根渗出过程空间差异的信息。)2.3biosensors: bacterial strainscontaining genetically encoded biosensors have beencombined with specialized imaging technology to detect metabolite exudationinto the rhizosphere.Disadvantage: these transgenically expressed biosensorshave a relatively narrow range of detection, and the transgenic bacterialcolonies have to be maintained and cultivated uniformly in the growth medium toeffectively assess Glc exudation processes.(2.3生物传感器:含有基因编码生物传感器的菌株已被发现结合专门的成像技术检测代谢产物渗出到根际。缺点:这些转基因表达的生物传感器检测范围较窄,需要在生长培养基中均匀的维持和培养转基因菌落,才能有效的评估Glc渗出过程。)
此次的技术:
新技术:a gel-based enzyme-coupled colorimetricand fluorometric (凝胶酶联比色法和荧光法
验证结果使用的技术:high-performance anion-exchange(HPAE) chromatography
显色的原理:
该检测方法利用葡萄糖氧化酶 (GO) 和辣根过氧化物酶 (HRP) 以及化合物 10-乙酰3, 7-二羟基苯氧嗪 (Ampliflu Red)。如果检测成分遇到葡萄糖, 则通过葡萄糖氧化酶将其转化为葡萄糖内酯和过氧化氢。然后, HRP催化释放的过氧化氢和无色 (非荧光) Ampliflu Red之间的反应, 形成洋红色(荧光)。
除了直接观察颜色变化,还利用荧光显微镜成像,高效液相色谱法(HPAE)定量检测根部分泌葡萄糖含量(将种植两天的玉米幼苗根部移放在滤纸上30min,从三份样品(每份样品中提取9株幼苗渗出液)中提取Glc并定量


实验对象:
bean菜豆 (Phaseolus vulgaris)‘Blue Lake 274’; cotton陆地棉(Gossypium hirsutum) ‘AU90810’,;maize玉米 (Zeamays) ‘B73’; rice大米 (Oryza sativa) var Swarna,; sorghum高粱 (Sorghum bicolor) ‘Macia’;soybean 大豆(Glycine max) ‘Williams 82’, and wheat小麦 (Triticum aestivum) var Coker 9553

用McLaughlin和Boyer(2004)改进的凝胶酶偶联比色法和荧光法观察了初生根的Glc渗出。两个玻璃板(20厘米×20厘米×0.2厘米)隔开一个胶泡沫板(Fiber-Craft)图样制作模具的不同维度(12厘米×2厘米×0.2厘米浇灌的植物和9厘米×2厘米×0.2厘米缺水的植物)和活页夹夹在一起。
液体凝胶混合物包含0.05摩尔每升的磷酸缓冲液,PH为7.4, 1.5%的低凝琼脂糖和1毫摩尔每升的CaSO4,加热到65°C以上溶解琼脂糖。将这个溶液是冷却到37°C(放置于水浴)和 GO 浓度为 1.8units mL-1, HRP浓度为1.5 units mL-1, Ampliflu Red浓度为 200 μM.。立即将凝胶混合物倒入特制的模具中冷却,在室温下形成凝胶。凝胶后(约20分钟),一个玻璃盘子被轻轻地和凝胶(连同其他玻璃板)上的铸型是放置在一个大培养皿(25厘米×25厘米×2.5厘米),储存在4°C至使用。由于扩增红在光下会氧化,所以凝胶是用绿色安全灯(Saab et al., 1990)制备的,并储存起来不受光照。轻轻将2日龄幼苗从蛭石中取出,将完整的初生根系置于凝胶上,盖上0.5 mm厚的玻璃板,确保根系与凝胶接触。小心地除去任何与根松散结合的蛭石,而不损害它们。将凝胶加热至室温,用数码相机在灯箱上捕捉反应过程。

分泌葡萄糖定量

将三个玉米种子的完整的初级根放置在用0.05m磷酸缓冲液(PH=7.4)浸润的滤纸上(50px*50px),收集初级根根尖和根基的分泌物。为了保证原生根与滤纸纸之间的适当接触,根系被玻璃板覆盖(0.5 mm)30分钟后,将滤纸存储在一个80°C冷冻直到进一步使用。通过Glc渗液可视化,确定了水分充足和水胁迫下幼苗根尖和根部的大小(1和图3)。在水分充足的幼苗中,根尖位于根尖0- 1.5 cm处,根底位于根尖5- 7 cm处。在水胁迫苗中,根尖在离根尖0- 25px处,根底在离根尖2- 100px处。
我们考虑在每克根干重的基础上表达Glc渗出物。然而,由于受水胁迫的根系有较厚的壁,它们比水分充足的组织更重,而且会错误地显示出较低水平的Glc渗出物(比本研究报告的水平要低)。因此,我们根据根(或根区域)的长度来计算Glc渗出量,以显示水分充足和水胁迫下根系Glc渗出量的差异。将根尖和根部的分泌物收集到filter纸片上。用2 mL甲醇:氯仿:(12:15:3)溶液从三份样品(每份含有9株幼苗分泌物的filter纸带)中提取Glc

经过提炼后的水溶液(2毫升)集中使用莎凡特500μL SpeedVac(ThermoFisher消解SC110)和相关样品被HPAE quantifed色谱法。

样品中Glc的浓度是通过测量已知的Glc标准得到的标准曲线来确定的。

控制filter纸带(不含渗出物或添加Glc)释放出可测量的Glc,定量从Glc的绝对定量中减去。

在不同的重复实验中,提取Glc的效果为65% ~ 87%,采用含450 ng d-Glc的样品(3filter纸带各含150 ng d-Glc)进行评价。

对照品(d-Glc或添加d-Glcfilter纸带)和根尖和根底分泌物样品一式三份进行分析。

数据意味着±se的一式三份样品。

字母表示样本之间的差异由单向方差分析,Student-Newman-Keuls测试(P≤0.05)

将根尖和根底渗出的Glc量归一化,进行Glc的回收。采用Excel (Microsoft)学生t检验,P < 0.05为差异有统计学意义。

发芽的种子放在蛭石中培养,29
实验结果

Maize roots in well-watered:图片fig1、fig2,figs2、figs6、tables1(首先可以证明根系分泌葡萄糖)

肉眼观察:
放入凝胶26min
First,Glc在玉米的初级根存在分泌。
Second, 初级根的根尖分泌的Glc少,根的其他部位分泌的Glc较多。
Third,对照组(不含GO)中根部无洋红色。
但在不含HRP的培养基中也存在洋红色(有研究表明,玉米初级根根部本身含有内生的过氧化酶,所以在不含HRP的培养基中,也显现出较少的洋红色。)
超过30min后,洋红色开始扩散。有可能是因为葡萄糖在凝胶中的扩散。

荧光显微镜成像结果:
First,根基比根尖荧光强度大,并且在20min左右荧光最明显(为什么有时间上的峰期,它的分泌是否具有周期)
Second,完全培养基中的初级根显示出的荧光强度比在不含HRP和不含GO的对照培养基中的根部荧光要强。

HPAE定量检测葡萄糖分泌量:
First,根基是根尖分泌量的几乎四倍多
Second,根尖的分泌速度7 ng Glc min1root−1 ,而根基的分泌速度为36 ng Glc min1root−1,5倍多的关系。

Maizeroots in watered-stressed:图片3A、figs2、fig3B

植物在缺水条件下,会积累己糖,以调节组织渗透压,提高抗旱能力,

肉眼观察:

放入凝胶26min

First,初级根分泌葡萄糖不存在空间差异性。(11min时还是具有空间差异性的,根尖分泌较根基少,22min后无差别)

Second,根尖与根际的分泌速度一样
Well-watered 与 water-stressed 相比:

First,胁迫下初级根分泌的葡萄糖少于水适宜条件下的初级根分泌的葡萄糖量,

Second,胁迫下根尖分泌是适宜水分下根尖分泌的2倍

Third, 适宜水分条件,根基分泌是胁迫下根基分泌的3倍

不同植物种类之间初级根分泌葡萄糖模式不同:

三种双子叶植物:菜豆、大豆、棉花

三种单子叶植物:大米、高粱、小麦

First,菜豆、大豆、大米的初级根分泌葡萄糖的模式:均匀的初级根上分泌;

Second,菜豆、大豆、大米初级根在C培养基和C-HRP培养基里的分泌情况相似,说明,这三种植物分泌葡萄糖速度很慢或者量很少,并且辣根过氧化酶(HRP)活性很高。

Third,棉花根尖分泌比根基多,根基几乎不分泌葡萄糖; Sorghum 和 wheat和玉米的初级根分泌模式相似,根基分泌多,根尖分泌少。

Fourth,与培养基接触相同时间下,wheat比sorghum 少。
讨论
先前收集植物根系分泌物是从水培溶液或用营养液冲洗的沙子中采集,分析的手段采用色谱技术定量分析了包括Glc在内的组成化合物,并不能展现根系分泌物的空间差异,在这篇文章之前,没有明显的直接证据证明根系分泌葡萄糖。玉米初级根根尖分泌的比跟其余部分少,但是先前的研究表明根尖部分葡萄糖浓度较高。作者对于这部分的解释:可能根尖(含分裂和伸长细胞)利用Glc进行各种代谢活动的速率远远高于初级根其他部分。对于不同植物初级根分泌葡萄糖的模式不同,可能是因为他们初级根对于葡萄糖的利用速率具有区域特异性。因此,玉米、高粱和小麦水分充足时,其初级根根系的空间变异性可能只是由于根尖与根基对Glc的利用存在差异。然而,这并不能解释在其他植物的根系中看到的空间模式,特别是棉花,因为它的根尖分泌葡萄糖随着时间量增加了。(作者没有解释)水分胁迫下的玉米根系虽然积累了较高的Glc浓度,但与水分充足的根系相比,分泌的Glc更少这与其需要进行渗透调节是相匹配的结果。这个方法还可用于评估其他植物组织中组织特异性Glc的体内定位,除了组织特异性,还能在不同状态下测定(例如冷冻的植物组织)
使用这个方法的注意点:
化合物 10-乙酰 3, 7-二羟基苯氧嗪(Ampliu Red)在光下易氧化, 甚至在黑暗条件下,也容易氧化,在强光下与荧光显微镜更容易配合使用。注意实验组织Glc分泌速率,只有当Ampliflu Red的初始浓度高于过氧化氢时,这个过氧化反应才能发生,非荧光红才能转化为粉红荧光。过量的过氧化氢会进一步将粉色/荧光型resorufn氧化成棕褐色/非荧光化合物,尽管速率比扩增型红色转化为resorufn30倍。
实验缺陷:
根际存在各种菌,他们分泌的葡萄糖也有可能影响根系显色结果。
进一步实验:
不同植物glc释放模式对根际微生物种群的影响
水胁迫根系葡萄糖分泌模式变化根际致病菌群变化

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